A seguito del tragico Sacco di Roma del 1527, Mattioli riparò nel territorio del principato vescovile di Trento e pose la propria residenza a Cles, iniziando a esercitare l’arte medica. La sua reputazione lo portò alla corte del principe vescovo Bernardo Cles, che nel 1528 lo volle alla corte di Trento come medico, botanico e consigliere personale. Lì entrò in contatto con i più grandi umanisti italiani ed europei, fra i quali Erasmo da Rotterdam. Tra il 1530 e il 1534 pubblicò a Bologna la sua prima opera, il Morbi Gallici novum ac utilissimum opusculum, ristampato poi in un’antologia dedicata al cardinale Cles. In essa Mattioli proponeva come rimedio alla sifilide una cura a base di mercurio, che ben presto divenne quella più diffusa in tutto il continente. Nello stesso anno accompagnò Bernardo Cles a Napoli, per incontrare l’imperatore Carlo V. Nel 1539 pubblicò a Venezia “Il magno palazzo del cardinale di Trento”, poema celebrativo dei lavori al Castello del Buonconsiglio. Alla morte del cardinale, avvenuta nel 1539, Mattioli venne congedato e quindi il medico si trasferì nuovamente a Cles, ospite della omonima famiglia: nel 1540 accompagna la nobile Anna Wolkenstein, moglie di Aliprando Cles, nipote di Bernardo, ai bagni di Bormio. Le peggiorate condizioni economiche lo portarono a trasferirsi a Gorizia, dove completò la sua opera più importante, i Di Pedacio Dioscoride Anazarbeo libri cinque della historia et materia medicinale tradotti in lingua volgare italiana. Il libro rappresenta il più noto testo botanico-farmaceutico del XVI secolo, nel quale il commento alla traduzione del De materia medica di Dioscoride Pedacio, summa delle nozioni di medicina naturale del tempo, era integrato con aneddoti e notizie legati alla tradizione popolare e con l’aggiunta della descrizione delle virtù medicinali di centinaia di nuove piante. Da ricordare anche la sua passione per la cartografia, come testimoniato dalla sua mappa topografica dell’Anaunia, “Le Valli d’Annone e di Sole”. La fama di Mattioli si spinse oltre i confini della penisola italiana, tanto che Ferdinando I d’Asburgo lo chiamò alla corte di Praga come medico personale del suo secondogenito. Proprio Ferdinando, il 13 luglio 1562, nominò Mattioli consigliere aulico e nobile del Sacro Romano Impero. Dopo la morte di Ferdinando, avvenuta nel 1564, il successore Massimiliano II propose a Mattioli di continuare il servizio alla corte imperiale, che perdurò così fino al 1571. Nel 1569 sposò in terze nozze una donna trentina, Susanna Caerubina, dedicandosi ancora a opere di medicina e farmacopea. Nei primi mesi del 1578 si trovava in visita a Trento e lì morì di peste.
